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        小鼠白介素17(IL-17)ELISA試劑盒英文文獻

         IFN-g induced by IL-12 administration prevents diabetes by inhibiting pathogenic

        IL-17 production in NOD mice

        Jun Zhang, Zhan Huang, Rui Sun, Zhigang Tian**, Haiming Wei*

        Institute of Immunology, Hefei National Laboratory for Physical Sciences at Microscale, University of Science and Technology of China, China

        article info

        Article history:

        Received 16 August 2011

        Received in revised form

        8 November 2011

        Accepted 28 November 2011

        Keywords:

        Type 1 diabetes

        Interleukin 12

        IFN-g

        Interleukin 17

        Dendritic cells

        abstract

        Interleukin 12 (IL-12) is a pivotal Th1-associated cytokine and a potent immunoregulatory molecule.

        However, the role of IL-12 in inducing immune tolerance that prevents insulitis and inhibits type 1

        diabetes (T1D) remains unknown. The aim of this study was to investigate whether intermittent

        administration of IL-12 could prevent the development of T1D in nonobese diabetic (NOD) mice. We

        examined whether IL-12 treatment prevented diabetes by injecting different doses of IL-12 into NOD

        mice and compared the incidence of diabetes and insulitis in NOD mice with the incidence in control

        mice. Furthermore, we investigated the potential mechanisms of IL-12-mediated prevention of diabetes

        and insulitis. The expression of pro-in?ammatory and immunoregulatory cytokines was measured before

        and following therapeutic administration of IL-12 in NOD mice. Our data demonstrated that both the

        absolute number and the function of DCs were impaired in NOD mice and that the levels of the Th17-

        associated pro-in?ammatory cytokines, IL-1b, IL-6 and IL-23, were elevated in NOD mice compared

        with age-matched BALB/c and C57BL/6 mice. However, treatment of NOD mice with IL-12 suppressed

        insulitis and increased the number of healthy islets, and the levels of IL-17, IL-1b, IL-6 and IL-23 were

        signi?cantly decreased. Moreover, IL-12 treatment of NOD mice induced the secretion of IFN-g, a potent

        inhibitor of Th17 cells. These data indicated that intermittent administration of IL-12 prevented diabetes

        by inducing IFN-g, suppressing the pathogenic IL-17-producing cells and reducing the expression of

        Th17-associated pro-in?ammatory cytokines. Our results suggest a promising strategy for the treatment

        of human T1D and other Th17 cell-mediated autoimmune diseases.

        2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

        1. Introduction

        Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease thought to be

        caused by autoantigen-reactive T lymphocytes that mediate the

        destruction of insulin-producing b-cells located in pancreatic islets,

        eventually resulting in b cell loss, insulin de?ciency, and hyper-

        glycemia [1]. The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously

        develops insulin-dependent diabetes that strongly resembles

        human T1D [2,3]. Long-term administration of insulin in appro-

        priate doses is necessary to manage the blood glucose levels in T1D

        patients. However, use of exogenous insulin cannot preciselymatch

        endogenous insulin secretion, and this often leads to the risk of

        hypoglycemia and other severe complications [4]. The events that

        initiate T1D and the precise mechanisms of pancreatic b cell

        destruction are incompletely understood. Therefore, safe and

        effective therapies for T1D are urgently needed.

        DCs are professional antigen-presenting cells that initiate both

        innate and adaptive immunity [5]. DCs have the ability to produce

        large amounts of IL-12 and induce T cell maturation as well as Th1

        responses, and these functions have been demonstrated to be

        abnormal in both humans with T1D [6,7] and NOD mice [8]. Hence,

        modulation of DC biology with the purpose of reshaping the

        repertoire of T cells may be an attractive therapeutic option for the

        treatment of T1D.

        Increasing evidence from NOD mouse and human T1D studies

        suggests that Th17 cells play a crucial role in the pathogenesis of

        autoimmune diabetes. Several studies have shown an increase in

        the number of IL-17-producing cells and the secretion of IL-17 in

        NOD mice [9,10] as well as in the peripheral blood of patients with

        T1D [11,12]. However, the mechanism behind this increase and its

        relationship to the pathogenesis of T1D remain obscure. Substantial

        evidence has indicated that IFN-g plays a protective role in the

        * Corresponding author. School of Life Sciences, University of Science and Tech-

        nology of China, 443 Huang-shan Road, Hefei 230027, China. Tel.: þ86 551 360

        7379; fax: þ86 551 360 6783.

        ** Corresponding author.

        E-mail addresses: jackey80@mail.ustc.edu.cn (J. Zhang), zhhuang@mail.ustc.edu.

        cn (Z. Huang), sunr@ustc.edu.cn (R. Sun), tzg@ustc.edu.cn (Z. Tian), ustcwhm@ustc.

        edu.cn (H. Wei).

        Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

        Journal of Autoimmunity

        journal homepage: www.elsevier.com/locate/jautimm

        0896-8411/$ e see front matter 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

        doi:10.1016/j.jaut.2011.11.017

        Journal of Autoimmunity 38 (2012) 20e28experimental autoimmune encephalitismousemodel [13,14]. Here,

        mice lacking IFN-g develop severe autoimmune disease compared

        with wild-type mice, and this is attributed to the inhibitory activity

        of IFN-g against Th17 cells [15e17]. A similar effect of IFN-g on the

        inhibition of IL-17 production has been reported in autoimmune

        diabetes [9]. However, the potent inducer of IFN-g, IL-12, has been

        shown to be impaired in diabetes patients.

        IL-12 is an immunoregulatory cytokine that promotes cell-

        mediated immunity [18] and is produced mainly by activated

        antigen-presenting cells [19]. It has been demonstrated that IL-12

        plays a particularly important role in antitumor immunity

        [20e22]. Results from mouse models of intracellular protozoan,

        fungal and bacterial infections have indicated that IL-12 has a key

        role in protection against pathogens [23e25]. The role of IL-12 in

        autoimmunity is attracting increased attention. Previous studies

        have shown that IL-12 administration induces Th1 cells and

        accelerates autoimmune diabetes [26]. Consistent with these

        studies, it has been shown that daily administration of IL-12 to NOD

        mice induces a rapid onset of T1D in 100% of treated mice [27].In

        addition, recent study revealed an IL-12 speci?c antibody protected

        transplanted islets from in?ammatory damage [28]. However,

        another study showed that intermittent administration of IL-12

        markedly reduced the incidence of diabetes [29]. Moreover, IL-12

        treatment can directly induce high levels of IFN-g in the circula-

        tion. Taken together, the role of IL-12 is controversial, as it has been

        shown to have both disease-promoting and disease-protective

        roles in autoimmune diabetes. The reason for these opposing

        roles of IL-12 is unclear, but administration of IL-12 likely affects

        systemic immune regulation.

        In the current study, we found that both the absolute number

        and the function of DCs were impaired in NOD mice and that the

        levels of the Th17-associated pro-in?ammatory cytokines, IL-1b, IL-

        6 and IL-23, were elevated in NOD mice. We showed that the

        intermittent administration of IL-12 to NOD mice suppressed

        insulitis and increased the number of healthy islets. Finally, we

        demonstrated that the IFN-g induced by IL-12 administration

        prevented diabetes through a mechanism of inhibition of patho-

        genic IL-17 production in NOD mice.

        2. Materials and methods

        2.1. Mice

        Female NOD/Lt, BALB/c and C57BL/6 mice were obtained from

        the Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China). All

        mice weremaintained under speci?c pathogen-free conditions and

        received care in compliance with the guidelines outlined in the

        Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

        2.2. Evaluation of diabetes

        Diabetes was assessed bymonitoring blood glucose levels every

        week using an Accu-Chek Active meter system (Roche). Mice with

        two consecutive blood glucose measurements 16.6 mmol/L were

        considered diabetic. All mice were monitored for blood glucose

        levels from 12 to 30 weeks of age.

        2.3. Histological and immunohistological evaluation

        Pancreata were harvested from NOD mice, ?xed in 10%

        phosphate-buffered formalin (pH 7.2), and embedded in paraf?n

        for histological examination. Sections of 6 mm thickness were cut

        100 mm apart to prevent double counting of the same islet. Three

        sections per pancreaswere stainedwith hematoxylin and eosin and

        analyzed by light microscopy. The pancreas from six animals was

        counted in each experimental group. Insulitis scoring was per-

        formed according to the following criteria: severe insulitis, 50% or

        more of the islet area displayed in?ltration; mild insulitis, <50% of

        the islet area displayed in?ltration; peri-insulitis, in?ltration was

        restricted to the periphery of islets; and no insulitis, absence of cell

        in?ltration. Sections were also stained for insulin to assess insulin

        production (rabbit anti-insulin H-86; Santa Cruz Biotechnology)

        following the manufacturer’s instructions. Positive reactions were

        visualized with the peroxidase/DAB kit (Dako), and the nuclei were

        counterstained using hematoxylin.

        2.4. In vivo treatments

        NOD mice were givenweekly i.p. injections with different doses

        of recombinantmurine IL-12 (Peprotech) or normal saline from6 to

        12 weeks of age. These mice were monitored for blood glucose

        levels beginning at week 12 until 30 weeks of age. For the IL-12

        treatment group, 6w represents 6 weeks of intermittent treat-

        ment, and other time points represent the time after a single

        treatment. The mice were sacri?ced one week after the last treat-

        ment in the 6w treatment group.

        2.5. In vitro stimulation of dendritic cells

        Splenic DCs were isolated from 8 week-old female mice by

        FACSAria (BD Biosciences), purity of FACS-sorted DCs was routinely

        98e99%. After sorting, the DCs were cultured in 96-well ?at-

        bottom plates (2 105

        per well) in RPMI-1640 media supple-

        mented with 10% FBS. In vitro stimulation of DCs was achieved by

        exposure to LPS (1 mg/ml) for 6 h. Complementary DNA derived

        from DCs after stimulation was assayed by real-time PCR to deter-

        mine mRNA levels of cytokines.

        2.6. Flow cytometry

        Anti-CD4-PerCP-Cy5.5 (RM4-5), anti-CD4-Allophycocyanin

        (RM4-5), anti-CD11c-Allophycocyanin (HL3), anti-IL-17-PE (TC11-

        18H10), and anti-IFN-g-PE (XMG1.2) were purchased from BD

        Pharmingen. For intracellular cytokine analysis of IL-17 and IFN-g,

        the splenocytes (1 106

        cell/ml) were stimulated with PMA (30 ng/

        ml; SigmaeAldrich) and ionomycin (1 mg/ml; SigmaeAldrich). One

        hour later,monensin (5 mg/ml; SigmaeAldrich)was added for 4 h to

        prevent the secretion of induced cytokines into the supernatant.

        The antibodies used for intracellular analysis were anti-CD4-PerCP-

        Cy5.5 (RM4-5), anti-IL-17-PE (TC11-18H10), and anti-IFN-g-PE

        (XMG1.2). Isotype-matched controls were included in all experi-

        ments. Flow cytometry was performed on a FACS Calibur (BD), and

        data were analyzed using WinMDI2.9 software.

        2.7. ELISA

        The serum samples were kept at 80 C until cytokine

        measurement. Levels of IL-1b, IFN-g, IL-6, IL-17, and IL-23 were

        measured using commercially available ELISA kits (Cusabio) in

        accordance with the manufacturer’s protocol.

        2.8. Real-time quantitative RT-PCR

        Total RNA was extracted using the TRIzol reagent (Invitrogen).

        One microgram of total RNA was reverse-transcribed with an oli-

        go(dT)18 primer and quanti?ed on an ABI Prism 7000 Detection

        System. Ampli?cationwas performed for 40 cycles in a total volume

        of 30 mL, and productswere detected using SYBRGreen (Takara). The

        relative expression level of each target gene was determined by

        normalizing itsmRNA level to the internal control gene, b-actin. The

        J. Zhang et al. / Journal of Autoimmunity 38 (2012) 20e28 21primer sequences usedwere as follows: IFN-g,50

        -TAG CCA AGA CTG

        TGA TTG CGG-30

        (forward) and 50

        -AGA CAT CTC CTC CCATCA GCAG-

        30

        (reverse); IL-1b,50

        -GTT TTC CTC CTT GCC TCT GA-30

        (forward) and

        50

        -GCT GCC TAA TGT CCC CTT G-30

        (reverse); IL-6, 50

        -AGA CTT CCA

        TCC AGT TGC CTT-30

        (forward) and 50

        -TCT CAT TTC CAC GAT TTC CC-

        30

        (reverse); IL-12p40, 50

        -GGA AGC ACG GCA GCA GAA TA-30

        (forward) and 50

        -AAC TTGAGG GAG AAG TAG GAA TGG-30

        (reverse);

        IL-17, 50

        -GCA AGAGAT CCTGGT CCT GA-30

        (forward) and 50

        -AGC ATC

        TTC TCG ACC CTG AA-30

        (reverse); IL-23p19, 50

        -CTT CTC CGT TCC

        AAG ATC CTT CG-30

        (forward) and 50

        -GGC ACT AAG GGC TCA GTC

        AGA-30

        (reverse); IL-12p35, 50

        -GTG TCA ATC ACG CTA CCT CCT CT-30

        (forward) and 50

        -CCGTCT TCACCATGT CAT CTGT-30

        (reverse); IL-10,

        50

        - ATG CTG CCT GCT CTT ACT GAC TG-30

        (forward) and 50

        - CCC AAG

        TAA CCC TTA AAG TCC TGC-30

        (reverse); TNF-a,50

        -GGT GTT CAT CCA

        TTC TCTACC C-30

        (forward) and 50

        -GTC ACT GTC CCAGCATCT TGT-30

        (reverse); b-actin, 50

        -GCC GAT CCA CAC GGA GTA CTT-30

        (forward)

        and 50

        -TTG CCG ACA GGA TGC AGA A-30

        (reverse).

        2.9. Statistical analysis

        The data are expressed as mean standard error of the mean.

        Comparisons between two groups were performed using a two-

        tailed unpaired t test. *, P < 0.05; **, P < 0.001.

        3. Results

        3.1. Intermittent administration of IL-12 prevents spontaneous T1D

        in NOD mice

        Six-week-old female NOD mice were treated with 50, 100 or

        200 ng of IL-12 once perweek. Blood glucose levelsweremonitored

        weekly between 6 and 30 weeks of age.Mice receiving 200 ng of IL-

        12 once per week showed a striking delay in T1D incidence

        (Fig. 1A). Increased survival rates were also observed in mice

        treated with 200 ng of IL-12 in NOD mice (Fig. 1B). The prevention

        of the development of diabetes in NOD mice following IL-12

        (200 ng) treatment was associated with reduced insulitis and

        blood glucose levels even though 2 of 16 mice showed insulitis and

        high blood glucose levels (Fig. 1C). In contrast, the weekly blood

        glucose levels in control mice showed a consistent pattern of

        hyperglycemia in 15 of 20mice (Fig.1D). Overall, these data suggest

        that intermittent treatment with 200 ng of IL-12 can prevent dia-

        betes and enhance survival in NOD mice.

        3.2. IL-12 treatment diminishes insulitis and increases the number

        of healthy islets

        To determine whether intermittent treatment with IL-12

        diminished insulitis, histological examination of pancreata was

        performed. As indicated in Fig. 2, most of the islets in control mice

        exhibited intra-insulitis and low levels of insulin. In contrast, the

        majorities of islets in treated mice were not in?amed or had only

        mild peri-insulitis. The mice treated for one week had a higher

        percentage of isletswith no insulitis (47 vs.15%) or peri-insulitis (35

        vs. 28%) relative to the diabetic mice. The percentage of islets

        exhibiting severe and mild intra-insulitis was reduced in the

        treated versus diabetic mice (8 and 10% vs. 24 and 33%, respec-

        tively). Moreover, in the 6-week treatment group, although the

        total number of islets was increased compared with that of the

        diabetic group, the majority of islets exhibited no insulitis (67%),

        and only 20% and 11% of islets from the treated group showed peri-

        insulitis or mild intra-insulitis, respectively (Fig. 2C). In addition,

        Fig. 1. Intermittent administration of IL-12 prevents spontaneous T1D in NOD mice. Six-week-old female NOD mice were treated for 6 weeks with 50, 100 or 200 ng of IL-12. Blood

        glucose was monitored weekly, and mice with two consecutive blood glucose measurements 16.6 mmol/L were considered diabetic. All mice were monitored for blood glucose

        from 12 to 30 weeks of age. A, The incidence of diabetes was measured following IL-12 treatment. B, Survival rate was measured following IL-12 treatment every day. C, D, Blood

        glucose concentrations were detected in IL-12-treated or control mice.

        J. Zhang et al. / Journal of Autoimmunity 38 (2012) 20e28 22enumeration of islets indicated that IL-12-treated mice had

        a signi?cantly greater number of total islets than did control mice.

        The number of insulin-positive islets also increased from 36 2in

        the controlmice to 48 3 upon treatment with IL-12 in the 1-week

        treatment group and from26 5 in the controlmice to 41 2 upon

        treatment with IL-12 in the 6-week treatment group (Fig. 2D).

        These data indicate that the number of healthy islets signi?cantly

        increases after IL-12 treatment.

        3.3. The number and function of DCs is abnormal in NOD mice

        Splenocytes from age-matched BALB/c and C57BL/6 mice were

        analyzed for the expression of CD11c. Consistent with previous

        reports, the frequency of DCs in the spleens of NODmice, especially

        from diabetic (30w group) mice, was signi?cantly decreased

        compared with BALB/c and C57BL/6mice (Fig. 3A, B).Moreover, the

        absolute number of DCs in NOD spleens was lower than that from

        BALB/c or C57BL/6 mice (Fig. 3C). Complementary DNA derived

        from sorted DCs was assayed by real-time PCR to determine mRNA

        levels of IL-12p35 and IL-12p40, two subunit of the Th1-associated

        cytokine, IL-12. The result indicated that both IL-12p35 and IL-

        12p40 were signi?cantly reduced in DCs isolated from NOD mice

        compared with age-matched BALB/c and C57BL/6 mice (Fig. 3D, E).

        In addition, the level of IFN-g was signi?cantly lower in the serum

        of diabetic mice than in controls (Fig. 3F). Furthermore, in order to

        demonstrate the cytokine production of NOD DCs, we performed

        in vitro experiment to determine the functional abnormality of DCs

        isolated from NOD mice. The result indicated the level of IL-6

        transcript was signi?cantly elevated in DCs after LPS stimulation

        from NOD mice compared with age-matched BALB/c and C57BL/6

        mice. However, IL-12p35 and IL-12p40 were signi?cantly reduced

        in DCs after LPS stimulation from NOD mice compared with the

        control mice (Sup. 1). Taken together, there were fewer DCs in NOD

        mice, the ability of these DCs to produce IL-12was impaired and the

        serum level of IFN-g, a major immunoregulatory cytokine, was also

        decreased in NOD mice.

        3.4. IL-12 treatment decreases pro-in?ammatory cytokines in NOD

        mice

        We next evaluated pro-in?ammatory cytokines,whichmay play

        an important role in insulitis in NOD mice. The level of IL-1b

        transcript was signi?cantly elevated in sorted DCs from diabetic

        NODmice compared with the control mice (Sup. 2A). Also in sorted

        DCs, IL-6 mRNA levels showed a 4-fold increase in NOD mice

        compared with age-matched BALB/c and C57BL/6 mice (Sup. 2B).

        However, the difference in IL-23 mRNA levels was not signi?cant

        between these groups (Sup. 2C). The mRNA levels of pro-

        in?ammatory cytokines were also measured in the pancreata. IL-

        1b and IL-23 were signi?cantly increased in the diabetic NOD mice

        compared with the control mice; although the difference was not

        statistically signi?cant, the level of IL-6 in diabetic NOD mice was

        also higher than that of the controlmice (Sup. 2D, 2F). Interestingly,

        the level of IL-6was signi?cantly reduced in the NODmice (6weeks

        old) compared with BALB/c and C57BL/6 mice (Sup. 2E).

        To establishwhether the IL-12 effect was due to a suppression of

        the pro-in?ammatory cytokines in NOD mice, we measured pro-

        in?ammatory cytokines at various time points following IL-12

        Fig. 2. IL-12 treatment diminishes insulitis and increases the number of healthy islets. For the pancreatic histology, three sections per pancreas (6 mm thick, cut 100 mm apart) from

        six untreated diabetic and IL-12-treated NOD mice were stained with hematoxylin and eosin (A) or anti-insulin antibody (B); images are representative of three independent

        experiments and analyzed at 400 magni?cation (scale bars indicate 50 mm). For the untreated diabetic mice, sections were generated at the second consecutive positive blood

        glucose reading. For the treated NOD mice, histology was performed 1-week or 6 weeks after the last treatment. C, Islets from untreated diabetic and IL-12-treated NOD mice were

        scored as described in Materials and methods, and the percentages represent the number of islets with a given score divided by the total number of islets from (A). D, Total islets per

        pancreas as determined by hematoxylin and eosin staining from the two groups of treated mice or control mice described in A, and six mice were included in each experimental

        group. Only structures with visible islet cells and incomplete in?ltration were counted. *P < 0.05, **P < 0.01.

        J. Zhang et al. / Journal of Autoimmunity 38 (2012) 20e28 23treatment. The mean serum concentration of IL-23 following IL-12

        treatment was lower than that of untreated control mice (Fig. 4C),

        but the levels of IL-1b and IL-6 were not signi?cantly decreased

        (Fig. 4A, B). The levels of these pro-in?ammatory cytokines were

        also determined by real-time quantitative PCR in the pancreata.We

        found that IL-1b, IL-6 and IL-23 transcripts were signi?cantly

        decreased three days after IL-12 treatment in the pancreata.

        Overall, these ?ndings suggested that pro-in?ammatory cytokines

        were effectively suppressed following IL-12 treatment both

        systemically and locally in the pancreas (Fig. 4C).

        3.5. IL-12 treatment interferes with IL-17 production

        Th17 cells, distinct from Th1 and Th2 cells, represent a newly

        de?ned subset of pathogenic T cells. IL-1b and IL-6 are the

        differentiation factors necessary for Th17 cell development,

        whereas IL-23 is dispensable for Th17 cell function, but necessary

        for Th17 cell survival and expansion. In contrast, IFN-g, IL-25 and IL-

        27 potently inhibit Th17 development [30]. The results above

        indicated that IL-1b, IL-6 and IL-23 were signi?cantly increased in

        NOD mice, especially in diabetic NOD mice, compared with age-

        matched BALB/c and C57BL/6 mice. In addition, IL-12 treatment

        modulated the expression of these pro-in?ammatory cytokines.

        Recent data have indicated that IL-17-producing CD4þ T cells play

        a pivotal role in the pathogenesis of T1D [9,31]. Similar results were

        observed in our study when splenocytes were analyzed for intra-

        cellular production of IL-17. The proportion of Th17 cells gradually

        increased with age and disease progression in the spleen, and IL-12

        treatment effectively interfered with IL-17 production (Fig. 5A and

        B). In addition, the mean serum concentration of IL-17 clearly

        Fig. 3. The number and function of DCs are abnormal in NOD mice. A, Flow cytometric analysis of CD11cþ DC populations in the splenocytes of NOD mice compare with BALB/c or

        C57BL/6 mice. B, The frequency of DCs was analyzed in the spleens of NOD mice compared with control mice. C, DCs were counted in the spleens of NOD mice compared with

        controls. Values are shown as means SE (n ¼ 6). D and E, The cDNA derived from sorted DCs was assayed by real-time PCR for IL-12p35 and IL-12p40 mRNA levels. F, Concentration

        of IFN-g was measured by ELISA in sera of NOD, BALB/c and C57BL/6 mice. Values are shown as means SE (n ¼ 6).

        J. Zhang et al. / Journal of Autoimmunity 38 (2012) 20e28 24increased when themice progressed to diabetes (Fig. 5C); however,

        the IL-17 levels were strongly suppressed after one week of IL-12

        treatment. Similar results were observed in the pancreas by

        quantitative real-time PCR (Fig. 5D). These data, which are consis-

        tent with previous reports [31], suggest that Th17 cells play

        a crucial role in the pathogenesis of autoimmune diabetes.

        3.6. IL-12 treatment induces protective IFN-g responses in NOD

        mice

        Previous studies have shown that IFN-g can potently inhibit

        Th17 development and that the Th1-associated cytokine, IL-12, can

        contribute to the production of IFN-g. Therefore, we examined the

        production of IFN-g following IL-12 treatment. As expected, the

        production of IFN-g from CD4þ T cells was markedly increased

        following IL-12 treatment as determined by FACS analysis of sple-

        nocytes (Fig. 6A and B). The mean serum concentration of IFN-g

        following IL-12 treatment was also higher than that found in

        control mice (Fig. 6C). In addition, IFN-g mRNA was signi?cantly

        elevated in the pancreas (Fig. 6D). In summary, IL-12 strongly

        suppresses pathogenic Th17 development by promoting the

        production of protective IFN-g.

        4. Discussion

        Previous studies have indicated that IL-12 promotes the acti-

        vation of NK and CD8þ T cells and regulates memory CD8þ T cell

        differentiation. In addition, IL-12 initiates tumor rejection and

        regulates infectious diseases. However, the role of IL-12 in auto-

        immune diabetes remains controversial. In the present study, we

        demonstrated that intermittent administration of IL-12 resulted in

        a protective effect in NOD mice, which is consistent with previous

        reports [29]. Loss of IL-12 results in enhanced pro-in?ammatory

        cytokine production and accelerated pathological damage of the

        pancreas in NOD mice. This accelerated disease is also associated

        with an increased number of IL-17-producing T cells. In our study,

        we showed that T1D in NOD mice was a Th17-initiated process and

        that known cytokines that strengthen Thl responses did not exac-

        erbate disease. Furthermore, the Thl cytokine, IFN-g, displayed

        inhibitory activity against Th17 cells. These results and those of

        others [26,27] also indicate that injection of IL-12 can have very

        different results depending on the dose and timing of administra-

        tion. Weekly administration of IL-12 was more effective in pre-

        venting the development of diabetes than when IL-12 was

        administered more frequently. The half-life of IL-12 in vivo is

        approximately 4e6h [27], but IL-12 levels and the cell-mediated

        immunity induced by IL-12 are sustained for far longer periods.

        In a previous report, Trembleau et al. administered IL-12 to IFN-g/

        NOD mice, and this accelerated T1D development [26]. Based on

        the present study, we conclude that IL-12 administration to IFN-g-

        de?cient NODmice clearly could not induce the IFN-g that prevents

        Th17 responses. Other cytokines have also been reported to have an

        antagonistic effect on T1D development in NOD mice. For example,

        systemic over-expression of the immunomodulatory cytokine, IL-

        10, in NOD mice ameliorates diabetes through the induction of

        regulatory T cells [32]. Also, local expression of transgenic tumor

        necrosis factor-a (TNF-a) prevents diabetes onset in NODmice [33].

        In addition, transgenic BALB/c mice expressing IFN-g in their

        pancreatic b-cells are resistant to STZ-induced diabetes [34]. It has

        also been reported that GM-CSF, IL-4 and TGF-b can delay or reduce

        T1D development [35,36]. Here, we suggest that following inter-

        mittent administration of IL-12, Th17-associated pro-in?ammatory

        cytokines are effectively reduced and Th1-associated IFN-g is

        elevated, which inhibits the pathogenic IL-17-producing T cells.

        Ultimately, the balance of cytokines was restored in the IL-12-

        treated NOD mice.

        DCs are a primary source of IL-12. Patients with DC de?ciencies

        can develop autoimmune diseases [37]. This phenomenon suggests

        a role for DCs inmediating peripheral tolerance, T cell anergy or the

        expansion of antigen-speci?c regulatory T cells [38]. Our results

        demonstrated that DCs fromNODmicewere in a pro-in?ammatory

        state and secreted high levels of IL-1b, IL-6 and IL-23. The latter pro-

        Fig. 4. IL-12 treatment decreased pro-in?ammatory cytokines in NOD mice. A, B and C, The mean serum concentrations of the pro-in?ammatory cytokines were measured at

        different time points following IL-12 treatment in NOD mice by ELISA. D, E and F, Relative levels of mRNA of the pro-in?ammatory cytokines were determined by real-time PCR from

        the pancreas of NOD mice at different time points following IL-12 treatment. Values are shown as means SE (n ¼ 6).

        J. Zhang et al. / Journal of Autoimmunity 38 (2012) 20e28 25Fig. 6. IL-12 treatment induced protective IFN-g in NOD mice. A, Flow cytometric analysis of the production of IFN-g from the CD4þ T cells isolated from the spleens of NOD mice at

        different time points following IL-12 treatment. B, The percentage of CD4þ IFN-gþ T cells is shown. Values are shown as means SE of six mice within each experimental group. C,

        The mean serum concentration of IFN-g was measured at different time points following IL-12 treatment in NOD mice by ELISA. D, Relative levels of IFN-g mRNA in the pancreas of

        NOD mice were determined by real-time PCR at different time points following IL-12 treatment. Values are shown as means SE (n ¼ 6).

        Fig. 5. IL-12 treatment interfered with IL-17 production. A, Flow cytometric analysis of IL-17-producing cells populations in the lymphocytes isolated from the spleen from different

        ages of mice or from different time points under IL-12 treatment in NOD mice. B, The percentage of CD4þ IL-17þ T cells is shown. Values are shown as means SE of six mice within

        each experimental group. C, The mean serum concentration of IL-17 was measured at different time points following IL-12 treatment in NOD mice by ELISA. D, Relative levels of

        mRNA for IL-17 were determined from the pancreas of NOD mice at different time points following IL-12 treatment. Values are shown as means SE (n ¼ 6).

        J. Zhang et al. / Journal of Autoimmunity 38 (2012) 20e28 26in?ammatory cytokines were also elevated in pancreata. In

        contrast, the level of IL-12 in DCs was signi?cantly decreased

        compared with the levels observed in control mice. These results

        suggest that IL-12 reduced the levels of pro-in?ammatory cyto-

        kines and that higher levels of IL-12 may have a positive effect in

        the clinical therapy of diabetes. Thus, in our study, IL-12 was

        administered weekly to NOD mice from 6 weeks to 12 weeks and

        was effective in suppressing the incidence of diabetes. The mech-

        anism of this suppression was that IL-12 down-regulated the levels

        of IL-1b, IL-6 and IL-23 and prevented the development of auto-

        reactive Th17 cells in treated mice.

        The balance of cytokines is a crucial determinant of resistance or

        susceptibility in organ speci?c autoimmunity. Disease suscepti-

        bility may correlate with the expression of pro-in?ammatory

        cytokines, such as IL-17, IL-1b, IL-6, TNF-a and IFN-g, in experi-

        mental autoimmune encephalomyelitis (EAE) [39]. Th17 cells,

        distinct from Th1 and Th2 cells represent a newly de?ned subset of

        pathogenic T cells and have recently been shown to play a key role

        in the pathogenesis of type 1 diabetes in NOD mice. IL-1b and IL-6

        are the factors necessary for Th17 cell differentiation,whereas IL-23

        is dispensable for the function of Th17 cells but necessary for their

        survival and expansion. In contrast, IFN-g, IL-25 and IL-27 potently

        inhibit Th17 development.

        To investigate whether IL-12 treatment in?uenced various cell

        subsets, we analyzed the proportions of CD4þ Foxp3þ Tregs, CD8 T

        cells, NK cells, NKT cells and gd T cells following the administration

        of IL-12. We found that the changes in these cell types were not

        signi?cant (data not shown). These data suggest that IL-12 may

        maintain homeostasis by regulating diverse in?ammatory cyto-

        kines in NOD mice.

        Our results showed that IFN-g produced downstream of IL-12

        inhibited the development of Th17 cells. In addition, IL-12 indi-

        rectly inhibited the Th17 cells by suppressing the Th17-associated

        pro-in?ammatory cytokines, IL-1b, IL-6 and IL-23. Thus, IL-12

        broadly regulated pathogenic Th17 cells and promoted the

        balance of cytokines in a direct or indirect way. The present study

        therefore provides the ?rst direct evidence that IL-12 plays

        a protective role in the development of T1D in NOD mice and

        suggests that IL-12, a possible therapeutic agent against infectious

        diseases and tumors, may also be valuable in the clinical treatment

        of diabetes.

        Author contribution

        Jun Zhang designed and performed the experiments, analyzed

        and interpreted the data. Zhan Huang analyzed and interpreted the

        data. Rui Sun established techniques of FACS and histochemistry.

        Zhigang Tian provided strategic planning and conceived the

        project. HaimingWei supervised the project, provided crucial ideas

        and helped with data interpretation. Jun Zhang wrote the manu-

        script with Haiming Wei and Zhan Huang.

        Con?ict of interest

        No potential con?icts of interest relevant to this article were

        reported.

        Acknowledgments

        This work was supported by the Natural Science Foundation of

        China (30730084, 31021061 and 91029303) andMinistry of Science

        & Technology of China (973 Basic Science Project 2007CB815805,

        2007CB512405 and 2009CB522403).

        The authors thank Weici Zhang (University of California, Davis)

        for her expert technical assistance.

        Appendix. Supplementary material

        Supplementary material associated with this article can be

        found, in the online version, at doi:10.1016/j.jaut.2011.11.017

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